Lundi 18 septembre 2023, Maxence Derbez Morin soutiendra sa thèse de doctorat portant sur le développement de méthodes de quantification de biomarqueurs de diagnostic du sepsis par spectrométrie de masse.
Les travaux de recherche réalisés dans le cadre de cette thèse ont été menés au sein du Service de Pharmacologie et d'Immunoanalyse du CEA et du LNE Paris. Ils ont permis de développer une méthode LC-hrMS/MS robuste et de produire des étalons rigoureusement caractérisés, primordial pour l’établissement de références métrologiques.
Résumé de la thèse
Le sepsis est un syndrome causé par une dérégulation du système immunitaire en réponse à une infection (bactérienne, virale, fongique), conduisant à une défaillance d’organes. En 2017, 48,9 millions de cas de sepsis ont été rapportés à travers le monde, causant la mort de 11 millions de personnes. Un diagnostic précoce et fiable est critique pour la mise en place rapide d’un traitement thérapeutique et pour améliorer la survie des patients.
Actuellement, le diagnostic du sepsis est basé sur l’évaluation clinique du patient, pouvant être impacté par des symptômes non spécifiques. La quantification individuelle de biomarqueurs comme la procalcitonine (PCT) ou la protéine-C-réactive (CRP) par des méthodes immunologiques représente alors une aide au diagnostic. Une quantification ciblant seulement un biomarqueur pouvant manquer de spécificité, le suivi simultané d’un panel de biomarqueurs apparait comme un atout majeur pour le diagnostic précoce.
Dans le cadre de ces travaux, une liste de neuf biomarqueurs protéiques d’intérêt pour le diagnostic du sepsis a été établie en collaboration avec des cliniciens et fabricants de kits de diagnostic. L’objectif a été ensuite de développer une méthode d’analyse protéomique ciblée par spectrométrie de masse à haute résolution (HRMS). Cette méthode a pour but de permettre une quantification spécifique, sensible et multiplexée de ces biomarqueurs dans le sérum en routine clinique.
Les protéines ciblées dans ces travaux présentent différentes masses moléculaires et concentrations sériques, ayant une gamme dynamique de l’ordre de 105 dans le sérum, chez les patients sains. La quantification par HRMS de ces protéines représente donc un challenge. La première étape a été de sélectionner deux peptides protéotypiques par protéine, au regard de différents critères comme la masse moléculaire ou la composition en acides aminés. Ces peptides ont ensuite servi à optimiser les conditions de chromatographie en phase liquide à haute performance (colonnes chromatographiques, phases mobiles, gradients d’élution), les conditions d’ionisation, de fragmentation et d’analyse en HRMS et les conditions de préparation de l’échantillon (précipitation des protéines, digestion enzymatique, extraction des peptides), permettant une quantification spécifique et sensible des protéines d’intérêt. Ces développements, ont permis d’identifier des protocoles de plus en plus sélectif, permettant ainsi une diminution des limites de quantification.
Ainsi, ce sont trois méthodes qui ont été développées: i) la première ciblant cinq protéines et répondant au besoin clinique (couvrant les concentrations physiologiques et pathologiques) et métrologiques (traçabilité métrologique), ii) la deuxième ciblant huit protéines et répondant au besoin clinique d’une méthode hautement multiplexée, iii) la dernière ciblant PCT permettant une comparaison avec une méthode de référence existante.
Afin d’assurer une quantification fiable et une traçabilité des résultats de mesure aux unités du SI, un étalonnage protéique a été mis en place pour les protéines disposant de matériaux de référence certifiés (protéines recombinantes), tandis qu’un étalonnage peptidique a été mis en place pour les autres protéines. Ainsi, il a été nécessaire de développer et caractériser rigoureusement les étalons peptidiques (évaluation de la pureté et quantification par analyse des acides aminés) au cours de ces travaux.
La validation de la première méthode et l’évaluation des incertitudes de mesure pour la quantification des cinq biomarqueurs dans le sérum humain, puis l’analyse d’échantillons cliniques, a permis d’évaluer son intérêt pour le diagnostic précoce et spécifique du sepsis en routine. D’un point de vue métrologique, le développement d’une méthode LC-HRMS/MS robuste et d’étalons rigoureusement caractérisés représentent une avancée importante pour l’établissement de références métrologiques.
Date et lieu de soutenance
Date : Lundi 18 septembre 2023 à 14h00
Lieu : salle de conférence du SPI, CEA Saclay