En France, le nombre d’individus atteints par la maladie d’Alzheimer est estimé à 860 000, ce qui fait de cette affection un véritable enjeu de santé publique. Cette pathologie est cependant encore mal diagnostiquée, la maladie étant la plupart du temps réellement identifiée au stade de démence, parfois avancée. Cela retarde de façon préjudiciable la prise en charge médicale et médico-sociale des patients et la possibilité de pouvoir disposer d’un diagnostic précoce s’avère donc cruciale.

Objectifs

Développer des méthodes de référence en spectrométrie de masse spécifiques et suffisamment sensibles pour permettre de quantifier des concentrations très basses de biomarqueurs de la maladie d’Alzheimer

Certifier des étalons de référence et des matériaux de référence avec les méthodes de référence développées

Résumé et premiers résultats

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Actuellement trois marqueurs biologiques du liquide céphalo-rachidien (LCR) semblent pouvoir permettre cette avancée : la diminution de la concentration des peptides Bêta Amyloïdes (1-40 et 1-42), l’augmentation de la concentration de la protéine t-Tau (plus particulièrement d’une forme phosphorylée de cette dernière : P-Tau(181)) et l’hepcidine, marqueur secondaire. Du point de vue analytique, ces marqueurs sont détectables dans le LCR par des techniques immunologiques, de type tests ELISA. Il faut cependant utiliser une combinaison de plusieurs de ces immuno-dosages pour couvrir les différents biomarqueurs nécessaires au diagnostic a minima de la maladie. En parallèle, depuis quelques années, des approches de spectrométrie de masse ciblées et quantitatives permettant de s’affranchir d’outils immunologiques sont développées. Leur utilité ne se résume pas aux méthodes de référence : elles disposent d’un très fort potentiel en biologie clinique où elles sont considérées comme une technologie d’avenir utilisable en routine. Un apport métrologique est nécessaire pour évaluer la justesse des méthodes utilisées en routine, raccorder les résultats aux unités du Système International, les rendre comparables d’une plate-forme analytique à une autre et in fine fournir des mesures plus fiables.

Le LNE est actuellement reconnu pour la fourniture des valeurs de référence dans le cadre d’essais d’aptitude visant à évaluer la qualité des analyses de biologie médicale reposant sur le dosage de petites molécules. Toutefois, la quantification absolue de protéines présente une complexité nettement supérieure en raison de leur grande taille et de leur importante hétérogénéité structurale, qui rend difficile la définition du mesurande (car la protéine tau totale est en réalité constituée d’un mélange de protéines) et la caractérisation métrologique de la pureté des étalons primaires utilisés pour raccorder les résultats au système international d’unités.

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Détection des peptides béta-amyloïdes après fractionnement sur colonne MCX

L'objectif de ce projet consiste à développer, optimiser et valider des méthodes de référence en spectrométrie de masse ciblée pour la quantification absolue des biomarqueurs de la maladie d’Alzheimer. Cela concerne en particulier le dosage dans le LCR des formes 1-38, 1-40 et 1-42 des peptides bêta Amyloïdes, de la protéine Tau (Tau totale et P-Tau(181)), mais également d’un marqueur secondaire, l’Hepcidine. Ces thématiques ont fait l’objet d’un travail de thèse, soutenue en 2016.

Les principaux enjeux de ce projet résident dans la capacité à développer des méthodes spécifiques, sensibles pour permettre de quantifier de manière absolue des concentrations très faibles de biomarqueurs (quelques centaines de pg/mL) dans des milieux biologiques complexes.

Une fois ces méthodes de référence validées, elles ont pour vocation d’être utilisées pour certifier :

  • Des étalons internationaux permettant de standardiser et rendre traçables aux SI les résultats obtenus avec les méthodes immunologiques utilisées en routine ;
  • Des matériaux de référence permettant d’évaluer la justesse des méthodes de routine avant et après standardisation.

Les premières méthodes d’analyse des peptides β amyloïdes par spectrométrie de masse utilisaient les techniques MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization) et SELDI (Surface Enhanced Laser Desorption Ionization) couplées à un ToF (Time of Flight). Ensuite, des méthodes LC-MS/MS (Liquid Chromatography coupled to tandem Mass Spectrometry) ont été développées pour la quantification absolue des peptides β amyloïdes Aβ 1-40 et 1-42 principalement. Deux d’entre elles utilisant des protocoles similaires ont été reconnues par le Joint Committee for Traceability in Laboratory Medecine (JCTLM) comme méthodes de référence pour la quantification absolue du peptide Aβ 1-42 par LC-MS/MS. La quantification est basée sur la dilution isotopique par ajout d’un étalon Aβ 1-42 marqué isotopiquement.

Concernant la protéine Tau, une méthode de dosage de 7 peptides de la protéine dans le LCR a été développée par LC-MS/MS sur un spectromètre de masse de type triple quadripôle. Bien que ces 7 peptides ne permettent pas de discriminer les différentes isoformes de la protéine Tau, la méthode a été validée.

Finalement, cette étude a permis d’avancer sur la caractérisation de l’étalon hepcidine dans le but de produire un matériau de référence certifié améliorant la comparabilité du dosage de l’hepcidine.

Impacts scientifiques et industriels

  • Développement de la méthode de dosage de peptides Bêta Amyloïdes par LC-MS/MS.
  • Dosage de la protéine Tau par extraction SPE de la protéine dans le LCR puis digestion par voie enzymatique et quantification par µLC-MS/MS.
  • Travaux en cours sur la caractérisation de deux étalons d’hepcidine issus de synthèses différentes par LC-hrMS et mobilité ionique.

Publications et communications

ELABY C., VIALARET J., BROS P., GABELLE A., LEFEBVRE T., PUY H., HIRTZ C., LEHMANN S., “Clinical measurement of Hepcidin-25 in human serum: Is quantitative mass spectrometry up to the job?”, EuPA Open Proteomics, 3, 2014, 60-67.

BROS P., DELATOUR V., VIALARET J., LALERE B., BARTHELEMY N., GABELLE A., LEHMANN S. et HIRTZ C., “Quantitative detection of amyloidbetapeptides by mass spectrometry: state of the art and clinical applications”, Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (CCLM), 53, 10, 2015, 1483-1493, DOI: 10.1515/cclm-2015-099.

BROS P., VIALARET J., BARTHELEMY N., DELATOUR V., GABELLE A., LEHMANN S. et HIRTZ C., “Antibody-free quantification of seven tau peptides in human CSF using targeted mass spectrometry”, Frontiers in Neuroscience, 9, 2015, 302, 1-8, DOI: 10.3389/fnins.2015.00302.

LEHMANN S., BREDE C., LESCUYER P., COCHO JA., VIALARET J., BROS P., DELATOUR V. et HIRTZ C., “Clinical mass spectrometry proteomics (cMSP) for medical laboratory: What does the future hold?”, Clin Chim Acta,  S0009-8981(16), juin 2016, pii: 30246-7, DOI: 10.1016/j.cca.2016.06.001.

DELABY C., BROS P., VIALARET J., MOULINIER A., DELATOUR V., GABELLE A., LEHMANN S., HIRTZ C., “Quantification of hepcidin-25 in human cerebrospinal fluid using” LC-MS/MS Bioanalysis, 9(4), 2017, 337-347, DOI: 10.4155/bio-2016-0240.

BROS P., JOSEPHS RD., STOPPACHER N., CAZALS G., LEHMANN S., HIRTZ C., WIELGOSZ RI., DELATOUR V.,  “Impurity determination for hepcidin by liquid chromatography-high resolution and ion mobility mass spectrometry for the value assignment of candidate primary calibrators”, Anal Bioanal Chem, 409, avril 2017, 2559-2567,  DOI: 10.1007/s00216-017-0202-4.

BRINET D., GAIE-LEVREL F., DELATOUR V., KAFFY J., ONGERI S. et TAVERNA M., “In vitro monitoring of amyloid β-peptide oligomerization by Electrospray differential mobility analysis: An alternative tool to evaluate Alzheimer's disease drug candidates”, Talanta, 165, 2017, 84-91, DOI: 10.1016/j.talanta.2016.12.011.

DELATOUR V., PEIGNAUX M., LALERE B. et VASLIN-REIMANN S., « Caractérisation et quantification de peptides pour la protéo-mique quantitative », Adebiotech, Paris, France, 3 octobre 2012.

BROS P., BARTHELEMY N., VIALARET J., BECHER F., GABELLE A., DELATOUR V., LEHMANN S. et HIRTZ C., Comparison of PRM and SRM analytical performances for the quantification of Tau protein in human C”, SMAP 2014 : Congrès français de Spectrométrie de Masse et d’Analyse Protéomique, Lyon, France, juin 2014.

BROS P., DELABY C., DELATOUR V., MOULINIER A., CAZALS G., VIALARET J., LEHMANN S. et HIRTZ C., “Towards a reference method for absolute quantification of hepcidin-25 in serum by mass spectrometry”, Congrès Euromedlab/IFCC, Paris, France, 21-25 juin 2015.

Partenaires

  • Laboratoire de Biochimie et de Protéomique Clinique de l’IRB (Institut de Recherches en Biothérapie, Montpellier),
  • CEA Saclay,
  • faculté de pharmacie de Chatenay Malabry,
  • LGC (UK),
  • PTB (DE),
  • SP (SE),
  • INIRM (IT),
  • Hôpital universitaire de la Charité de Berlin (DE),
  • University College London (UK),
  • CHU Montpellier,
  • Université d'East Anglia,
  • PPD,
  • ADx NeuroSciences,
  • Roche,
  • Fujirebio,
  • Eurobio,
  • Eurogentec