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Il apparaît que contrairement aux autres domaines de la mesure, les résultats des analyses de biologie médicale ne sont à ce jour pas toujours traçables à des références reconnues internationalement (comme par exemple des matériaux de référence certifiés ou des méthodes de référence) et que les incertitudes de mesure ne sont pas systématiquement évaluées.

Cette situation est en contradiction non seulement avec la norme ISO EN 15189, mais également avec d’autres référentiels internationaux, comme notamment la Directive Européenne 98/79/CE qui exige que les produits de diagnostic in vitro soient traçables au Système International d’unités (SI) via des étalons de mesure d'ordre métrologique supérieur. Il est donc nécessaire de disposer de méthodes de référence pour le dosage des principaux biomarqueurs utilisés en biologie médicale.

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Le LNE a donc initié depuis 2006 des travaux dans le domaine biomédical afin d’évaluer et d’améliorer la fiabilité des analyses de biologie médicale. Ces travaux ont pour objectif d’assurer la traçabilité métrologique des résultats à des références reconnues internationalement et permettre la comparabilité des résultats dans le temps et d’un laboratoire à l’autre, même s’ils utilisent des techniques différentes. Ils permettent également d’évaluer les performances des méthodes utilisées en routine dans les laboratoires de biologie médicale et d’établir des recommandations concernant les méthodes devant être privilégiées.

Pour cela, la première étape consiste à développer et valider des méthodes de référence d’ordre supérieur pour le dosage des principaux biomarqueurs utilisés en biologie clinique. Compte tenu du nombre considérable de paramètres mesurés en routine en biologie clinique, il a été indispensable de prioriser les biomarqueurs pour lesquels une méthode de référence devait être développée. Ce choix a été effectué en concertation avec les autorités de santé publique (ANSM, HAS, DGS). Les biomarqueurs prioritaires retenus sont ceux associés aux principales pathologies humaines (maladies cardiovasculaires, diabète, …), afin de maximiser l’impact des travaux réalisés.

Ce projet a donc ciblé les activités relatives au dosage des biomarqueurs suivants : glucose, créatinine, hémoglobine glyquée HbA1c, cholestérol total, cholestérol-LDL, cholestérol-HDL et triglycérides, ainsi que le développement d’un matériau de référence certifié (MRC) pour l’ensemble de ces différents paramètres, à l’exception de l’HbA1c. La mise en œuvre de la Dilution Isotopique a permis d’assurer la traçabilité métrologique à la mole, unité du SI pour la quantité de matière.

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• Evaluation des performances des méthodes utilisées en routine dans les Laboratoires de Biologie Médicale (LBM)
• Amélioration des données de biologie clinique
• Fourniture de valeurs de référence dans le cadre de la réalisation d’essais d’aptitude à destination des LBM (échantillons de contrôle de la qualité de l’ANSM, …)
• Certification d’un matériau de référence
• Evaluation de la justesse des lecteurs de glycémie
• Evaluation de la commutabilité de matériaux d'étalonnage industriels et d’échantillons de contrôle qualité
• Evaluation de la qualité des lots d'étalons fournis par les fabricants
• Transfert des méthodes développées vers les équipes de recherche de CHU

DELATOUR ET AL, « Development of reference methods for the measurement of biomarkers in France », Ann. Biol. Clin., 68, 6, 2010, 698-699

DELATOUR V., LALÈRE B., DUMONT G., HATTCHOUEL J.-M., FROISSART M., DE GRAEVE J. et VASLIN-REIMANN S., “Development of a reference method for creatinine measurement to improve diagnosis and follow-up of kidney disease”, Revue française de métrologie, 26, 2011, 21-31, DOI: 10.1051/rfm/2011008.

PIERONI L., DELANEY P., BOUTTEN A., BARGNOUX A.-S., ROZET E., DELATOUR V., CARLIER M.-C., HANSER A.-M., CAVALIER E., FROISSART M. et CRISTOL J.-P., “A multicentric evaluation of IDMS-traceable creatinine enzymatic assays”, Clinica Chimica Acta, 412, 23-24, 2011, 2070-2075, DOI: 10.1016/j.cca.2011.07.012.

DELATOUR V., LALÈRE B., SAINT-ALBIN K., PEIGNAUX M., HATTCHOUEL J.-M., DUMONT G., DE GRAEVE J., VASLIN-REIMANN S. et GILLERY P., “Continuous improvement of medical test reliability using reference methods and matrix-corrected target values in proficiency testing schemes: Application to glucose assay”, Clinica Chimica Acta, 413, 23-24, 2012, 1872-1878, DOI: 10.1016/j.cca.2012.07.016.

HEUILLET M., LALÈRE B., PEIGNAUX M., DE GRAEVE J., VASLIN-REIMANN S., PAIS DE BARROS J., GAMBERT P., DUVILLARD L et DELATOUR V., “Validation of a reference method for total cholesterol measurement in human serum and assignation of reference values to proficiency testing samples”, Clinical Biochemistry, 46, 4–5, 2012, 359-364, DOI: 10.1016/j.clinbiochem.2012.11.026.

BOUTTEN A., BARGNOUX A.S., CARLIER M.C., DELANAYE P., ROZET E., DELATOUR V., CAVALIER E., HANSER A.M., FROISSART M., CRISTOL J.-P. et PIÉRONI L., “Enzymatic but not compensated Jaffe methods reach the desirable specifications of NKDEP at normal levels of creatinine. Results of the French multicentric evaluation”, Clinica Chimica Acta, 419, 2013, 132-135, DOI: 10.1016/j.cca.2013.01.021

FLAMANT M., VIDAL-PETIOT E., METZGER M., HAYMANN J.P., LETAVERNIER E., DELATOUR V., KARRAS A., THERVET E., BOFFA J.J., HOUILLIER P., STENGEL B., VRTOVSNIK F. et FROISSART M., “Performance of GFR Estimating Equations in African Europeans: Basis for a Lower Race-Ethnicity Factor Than in African Americans”, Am. J. of Kidney Disease, 62, 1, 2013, 182-184, DOI: 10.1053/j.ajkd.2013.03.015.

DELATOUR V., LALÈRE B. et VASLIN-REIMANN S., “Development of reference methods for the measurement of biomarkers”, IMEKO TC Conference (TC8 - TC23 - TC24) “Metrological traceability in the globalisation age”, Paris, France, 6-8 avril 2011.

HEUILLET M., DELATOUR V., LALERE B. et VASLIN-REIMANN S., “How to perform traceable measurements for biomarkers quantification”, 15^e Congrès international de métrologie, Paris, France, 3-6 octobre 2011.

DELATOUR V., HEUILLET M., PEIGNAUX M., LALERE B. et VASLIN-REIMANN S., « Apport de la spectrométrie de masse et des méthodes de référence pour le contrôle qualité en biologique clinique », 29^es Journées Françaises de Spectrométrie de Masse, Orléans, France, 17–20 septembre 2012.

HEUILLET M., DELATOUR V., PEIGNAUX M., LALERE B., DE GRAEVE J., VASLIN-REIMANN S. et DUVILLARD L., « Développement et validation d’une méthode de référence pour le dosage du cholestérol total et application au contrôle qualité en biologie clinique », 29^es Journées Françaises de Spectrométrie de Masse, Orléans, France, 17–20 septembre 2012.

VASLIN-REIMANN S. et DELATOUR V., « Matériaux de Référence Certifiés pour la biologie médicale : une denrée rare en France ? », Journée Technique du Collège Français de Métrologie, Paris, France, 27 novembre 2012.

HEUILLET M., PEIGNAUX M., LALERE B., VASLIN-REIMANN S., DUVILLARD L. et DELATOUR V., “A commutability study coupled to a multicentric analysis of accuracy of total cholesterol, LDL-C, HDL-C and total glycerides assays”, Annual meeting of American Association for Clinical Chemistry, Houston, Etats-Unis, 28 juill.–1^er août 2013.

DELATOUR V., HEUILLET M., LALERE B. et VASLIN-REIMANN S., « Production d’un matériau de référence certifié pour le glucose, la créatinine et le cholesterol total et organisation d’une étude de commutabilité couplée à une étude multicentrique de la justesse des dosages de routine », 16^e Congrès international de métrologie, Paris, France, 7–10 octobre 2013.

• CHU de Dijon (Cholestérol),
• CHU de Reims (HbA1c, Glucose),
• CHU Montpellier (Créatinine)

On estime que l'atténuation du changement climatique coûtera à l'UE 4 % du PIB d'ici 2100.

Des instruments sensibles sont utilisés pour surveiller la tendance des concentrations de gaz à effet de serre et pour identifier les sources d'émissions halogénées. Ces instruments s'appuient sur des normes d'étalonnage de gaz extrêmement faibles et très spécifiques pour confirmer leurs performances. L'amélioration de la précision de la surveillance atmosphérique et l'identification des sources d'émission de gaz reposent sur la production de normes de gaz de référence ou de mélanges complexes de gaz halogénés ayant des liens solides avec les unités SI.

Ce projet a permis de développer des normes de bouteilles de gaz traçables SI et des normes de gaz de référence au point d'utilisation, notamment des normes de CO₂ correspondant isotopiquement au rapport ¹³CO₂/¹²CO₂ dans l'atmosphère.
Ce projet a également permis de développer avec succès une gamme de normes de gaz de référence traçables et de transfert optique pour l’amélioration de l’étalonnage des instruments de surveillance des gaz à effet de serre. Les normes récemment développées, par exemple, ont considérablement amélioré la précision des mesures de CO₂ atmosphérique effectuées par les réseaux nationaux et internationaux de surveillance des gaz à effet de serre du Royaume-Uni. Des normes de gaz de référence à l’état de traces contenant des mélanges complexes de gaz fluorés ont été utilisées dans les tests de systèmes sur le site de surveillance EMPA de Dübendorf (Suisse), introduisant une traçabilité robuste au SI pour leurs mesures.

Aide aux réseaux de surveillance du climat pour atteindre les objectifs de précision de mesure fixés par l’OMM et soutenir la mise en œuvre des réglementations et directives sur les émissions industrielles, notamment la législation de l’UE sur les gaz fluorés et la directive sur la qualité de l’air (2008/50/CE)

• NPL (Royaume-Uni)
• PTB (Allemagne)
• DFM (Danemark)
• METAS (Suisse)
• MIKES (Finlande)
• TÜBITAK (Turquie)
• VSL (Pays-Bas)
• CMI (République Tchèque)
• MIKES-FMI (Finlande)

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Très peu d’études se sont intéressées à ce jour à la question de la présence des NPs manufacturées dans les eaux naturelles, du fait de l’absence de méthodes analytiques adaptées au large spectre de NPs qui peuvent être rencontrées, aux faibles concentrations attendues dans les milieux aquatiques et à la complexité des matrices environnementales.

La mise en œuvre, avant la mesure, de la technique de fractionnement par couplage flux-force (FFF ou A4F) s’avère pertinente comme méthode séparative dans le cas de matrices complexes (environnementale, agroalimentaire, cosmétique, …). Via son couplage à différents types de détecteurs (UV, fluorescence, spectrométrie de masse à plasma induit (ICP-MS), diffusion de lumière statique MALS ou dynamique DLS), cette technique permet par ailleurs d’accéder de façon directe à de nombreuses propriétés des nano-objets (concentration de particule en nombre, taille, distribution en taille, forme, état d’agrégation et/ou d’agglomération, composition élémentaire) qu’il est important de pouvoir caractériser dans un cadre réglementaire ou pour évaluer leur interaction avec l’environnement ou un organisme vivant. Les fractions séparées de l'échantillon peuvent par ailleurs être collectées et analysées « off-line » par des techniques complémentaires, telles que la microscopie électronique par balayage (MEB), en transmission (MET) ou la microscopie à force atomique (AFM), qui apportent de nouvelles informations, notamment sur la forme et la taille des particules.

La spectrométrie de masse à source à plasma induit, utilisée en mode comptage individuel (spICP-MS), est quant à elle une technique en développement ayant le potentiel d'apporter des réponses en terme de composition, de quantité et de distribution en taille des nanoparticules métalliques en suspension dans des matrices aqueuses pour des faibles concentrations pertinentes du point du vue environnemental. Dans les deux cas cependant, il reste encore beaucoup de développements à réaliser du point de vue de la métrologie pour fiabiliser les résultats qui peuvent être obtenus.

Ce projet vise à développer au LNE les compétences techniques nécessaires à la mise en route de nouveaux moyens analytiques de caractérisation des NPs, basés sur les deux techniques A4F-UV-MALS-ICP-MS et spICP-MS, afin d’en évaluer les performances métrologiques et les possibilités de couplage. Le projet se focalisera sur les NPs manufacturées de forme approximativement sphérique (SiO₂,TiO₂, Ag & CeO₂) et exploitera deux axes de recherche :

• la caractérisation des NPs manufacturées en réponse aux besoins de fiabilité appelés par le décret français n° 2012-232 du 17 février 2012 (déclaration annuelle obligatoire des substances à l’état nanoparticulaire imposée aux acteurs industriels et académiques français) et par la recommandation UE du 18 octobre 2011 (définition d’un nanomatériau) ;
• la caractérisation des NPs manufacturées dans des milieux environnementaux afin de mieux comprendre leur devenir dans l'environnement, ainsi que leur rôle dans le transport des polluants.

Le développement des compétences sur les deux techniques A4F-UV-MALS-ICP-MS et spICP-MS nécessitera initialement l'étude des NPs dans des systèmes simples et/ou modèles, avant de passer à des milieux plus complexes. Des compétences seront par ailleurs à développer dans le cadre du premier axe au niveau de l'étape de préparation des échantillons et de la caractérisation en taille.

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• Renforcement du positionnement LNE dans le domaine émergent des nanosciences, notamment par la mise en œuvre de techniques analytiques en plein essor et actuellement encore peu répandues (A4F et spICP-MS)
• Evaluation des performances métrologiques des techniques A4F et spICP-MS pour la caractérisation des NPs en milieux liquides
• Fiabilisation de l’étape pré-analytique en vue de la déclaration obligatoire des substances à l’état nanoparticulaire (décret n° 2012-232 du 17 février 2012)

• IPGP

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D’après les chiffres issus de la Convention de Stockholm (2012), la production mondiale de PBDE a été estimée à plus de 1,3 millions de tonnes sur la période 1970-2005. Ces substances, détectées dans l’environnement dès la fin des années 70, présentent par ailleurs un caractère lipophile (6,64<log Kow<9,97) et une faible dégradabilité qui font d’eux des Polluants Organiques Persistants (POP), toxiques pour l’homme et l’environnement.

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Différents textes ont réglementé l’emploi des PBDE au cours des quinze dernières années (Directive 2003/11/CE, Directive 2002/95/CE dite «RoHS», …). Plus récemment, l’OBDE et le PeBDE ont rejoint la liste des substances chimiques interdites par la Convention de Stockholm (mai 2009). Malgré ces interdictions, les PBDE sont aujourd’hui encore rejetés dans l’environnement lors de l’utilisation et de l’élimination des articles en contenant. Ils sont notamment présents dans l’air, à des concentrations qui varient selon les pays de 0,015 à 103,49 pg/m³, et se retrouvent davantage dans les matières en suspension (MES) et les sédiments (0,09-1163 ng/g de matière sèche) que dans l’eau (0,09-3620 pg/L) du fait de leur faible solubilité. De nombreuses études ont également mis en évidence la présence de PBDE dans la biote et chez les mammifères terrestres avec une contamination due à la fois à l’exposition directe et à la bioaccumulation. L’évaluation de la concentration de ces substances chimiques dans l’environnement s’avère par conséquent nécessaire. Le PeBDE est d’ailleurs classé en tant que substance dangereuse prioritaire et les PBDE intégrés à l’annexe X de la directive 2000/60/CE, communément appelée Directive Cadre sur l’Eau (DCE). Au travers de la Directive QA/QC (2008/105/CE), la DCE a fixé des Normes de Qualité Environnementale (NQE) à ne pas dépasser, dans les eaux de surface pour les congénères constituant le PeBDE (BDE-28, BDE-47, BDE-99, BDE-100, BDE-153, et BDE-154) et prévoit que l’analyse porte sur l’eau totale, c’est-à-dire la fraction dissoute (fraction liquide pouvant contenir jusqu’à 0,5 g/L de MES ou fraction liquide après filtration) et la fraction particulaire (fraction solide après filtration). A ces critères s’ajoutent ceux données par la Directive QA/QC, qui fixe les exigences suivantes : 

• les limites de quantification (LOQ) doivent être inférieures à 30 % de la valeur des NQE fixées,
• l'incertitude de mesure à la NQE doit être inférieure ou égale à 50 %.

Cela conduit à des concentrations très faibles à atteindre (< 0,025 ng/L) pour chacun des six congénères réglementés. Compte tenu notamment de la faible solubilité de ces produits, qui rend difficile leur extraction des matrices complexes, les méthodes d’analyse existantes ne satisfont pas les critères de performances analytiques requis dans le cadre de ces deux Directives. Il est donc apparu nécessaire de développer une méthode primaire de référence pour l’analyse simultanée de plusieurs PBDE dans différentes matrices environnementales (eaux et sédiments). Aux PBDE réglementés ont été ajoutés les BDE-183 et -209.

Deux méthodes d’analyse métrologiquement traçables à la mole ont été développées et optimisées :

• une méthode par GC/MS permettant l’analyse simultanée des BDE-28, -47, -100, -99, -154 et -153 à des teneurs allant de 2 ng/ml à 250 ng/ml suivant le congénère,
• une méthode par GC/MS-MS permettant l’analyse simultanée des BDE-28, -47, -100, -99, -154, -153, -183 et -209 à des teneur allant de 0,25 ng/ml à 250 ng/ml.

Il est apparu que seule la méthode impliquant la GC/MS-MS est en mesure de répondre aux exigences fixées par la DCE en terme de LOQ à atteindre. Les performances de cette méthode permettent par ailleurs l’analyse des BDE-183 et -209.

Dans le cas des matrices aqueuses, l’extraction sur phase solide (SPE) connue pour être plus rapide et plus faible consommatrice de solvants que l’extraction liquide-liquide (ELL) a été testée. Cela n’a cependant pas permis d’obtenir des taux de recouvrements suffisants (entre 20 et 78 % selon la composition de la phase des cartouches et les BDE considérés) et le choix final pour le développement de la méthode d’extraction sur des eaux synthétiques chargées en acides humiques (Carbone Organique Dissous = 5 et 7 mg/L) s’est porté sur la technique ELL. Cette méthode a pu être validée par une approche interne, ainsi que via une inter-comparaison impliquant d’autres laboratoires de métrologie européens (cf. Projet ENV08).

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Les résultats obtenus montrent que la méthode développée répond aux exigences de la DCE en terme de concentrations à atteindre et d’incertitudes de mesures pour des concentrations à la NQE. Les BDE-183 et –209 peuvent également être déterminés à de faibles valeurs et incertitudes de mesures.

Dans le cas des matrices solides (sédiments), une méthode d’extraction par PLE (méthode accélérée par solvant chaud sous pression) a été développée, optimisée et validée au moyen des Matériaux de Référence Certifiés (MRC) à matrice disponibles. Les résultats obtenus sont statistiquement conformes aux valeurs attendues pour le MRC, seul le BDE-28 ne pouvant pas être caractérisé, les  MRC disponibles ne contenant pas ce congénère.

Deux méthodes de référence primaires, justes et traçables, ont pu être développées et validées pour le dosage d’une large sélection de PBDE réglementés dans les eaux et les sédiments. Ces méthodes répondent aux critères données par la DCE, et la traçabilité métrologique à la mole, unité du SI pour la quantité de matière, est assurée par la mise en œuvre de la Dilution Isotopique. Ces méthodes seront mises à profit pour effectuer des tests de stabilité sur des matériaux de référence et pour fournir des valeurs de référence au cours d’essais d’aptitudes à destination des laboratoires de terrain (notamment dans le cadre du réseau AQUAREF), contribuant ainsi à une amélioration de la qualité des données de surveillance de la qualité de l’eau.

• Dépôt de CMC (Meilleures possibilités d’étalonnages et de mesurages) auprès du BIPM
• Fourniture de valeurs de référence dans le cadre de la réalisation d’essais d’aptitudes destinés aux laboratoires de surveillance de la qualité de l’eau / Fiabilisation des mesures réalisées dans le cadre du réseau AQUAREF

CABILLIC J., PHILIPP R., SCHIEL D., EMTEBORG H., GOENANA-INFANTE H. et LALERE B., “Joint Research Project ENV08 “Traceable measurements for monitoring critical pollutants under the European Water Framework Directive (WFD) 2000/60/EC”, 15^e Congrès international de métrologie, Paris, France, 3-6 octobre 2011.

LALERE B., LARDY-FONTAN S., CABILLIC J., LEDIOURON V. et  PEIGNAUX M., « Méthodologie et métrologie pour l’acquisition de mesures quantitatives fiables à l’état traces dans l’environnement », Colloque du DIM Analytics, Paris, France, 18–19 avril 2013.

CABILLIC J., HEIN S., LEHNIK-HABRINK P., CALABRETTA E., POTALIVO M., BELLI M., BILSEL M., GOKÇEN T., CEYHAN GOREN A., CRINA I., BUZUIANU M., LALERE B. et PHILIPP R., “Joint Research Project ENV08 : Traceable measurements for monitoring critical pollutants under the European Water Framework Directive (WFD) 2000/60/EC”, 16^e Congrès International de Métrologie, Paris, France, 7–10 octobre 2013.