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Les véhicules automobiles constituent une source majeure de pollution environnementale, à la fois du point de vue des contaminants atmosphériques primaires (CO, NO_x, SO_x et hydrocarbures), mais également du fait de la libération de nombreux éléments inorganiques lors du processus de combustion. Le mercure (Hg) est naturellement présent dans les combustibles fossiles, alors que les éléments du groupe du platine (PGE) proviennent de l’utilisation des pots catalytiques. Ces métaux (Pt,Pd, Rh) sont en effet utilisés à des teneurs de quelques 1000 mg/kg pour piéger et transformer les polluants primaires ; le rhodium est ainsi majoritairement utilisé pour la réaction de réduction des oxydes d'azote (NO_x) alors que les éléments platine et palladium sont actifs pour l'oxydation du monoxyde de carbone (CO) et des hydrocarbures.

Le projet européen ENV 02, financé dans le cadre du programme EMRP, a pour objectif de proposer des développements nécessaires du point de vue de la métrologie afin de mieux comprendre, mieux mesurer et par conséquent mieux contrôler ces émissions de gaz d’échappement automobiles (particules de suie, PGE et Hg⁰).

La réduction des émissions secondaires de PGE constitue notamment un enjeu important en termes de santé publique, écologique, mais également économique du fait de la rareté de ces éléments et donc de leurs coûts. L’étude de la cinétique d’émission de PGE en ng/km ne pourra par ailleurs être entreprise que si des méthodes primaires de référence sont développées pour la quantification du Pt, Pd et Rh, afin que la traçabilité métrologique des résultats obtenus par des analyses de routine puisse être assurée. Le LNE intervient plus particulièrement sur le développement de ces méthodes de mesure primaires qui mettent en œuvre la spectrométrie de masse ICP et une approche par Dilution Isotopique (DI) ou ajouts dosés, nécessaires pour assurer une traçabilité métrologique directe à la mole, unité du SI pour la quantité de matière.

La réalisation d’une étude bibliographique a permis d’identifier les interférences problématiques pour l’analyse par ICP-MS des PGE dans les émissions particulaires automobiles. Compte tenu des résolutions théoriques nécessaires pour le dosage de ces éléments, le développement de méthodes primaires relève d’un véritable défi analytique.

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Un protocole préliminaire sur  résine échangeuse de cations a été défini afin d’éliminer les interférences isobariques inhérentes à la matrice constituée par ce type d’échantillons. Ce prétraitement se devait d’être compatible avec la mise en œuvre de la méthode primaire de DI pour le Pt et le Pd et celle des ajouts dosés pour le Rh (élément mono-isotopique pour lequel l’approche par DI n’est pas applicable).

La validation des méthodes a été effectuée principalement sur le matériau de référence (MRC) BCR 723, seul MRC existant avec des teneurs certifiées pour les 3 PGE et dont la matrice est très proche des prélèvements de particules automobiles (poussières de la route prélevées dans un tunnel). Les valeurs obtenues par le LNE sont en très bon accord avec les valeurs certifiées. Les performances requises dans ce projet au niveau des incertitudes (1 % pour le Pt et Pd, et 2 % pour le Rh) semblent cependant, à l’exception du platine, difficiles à respecter pour des teneurs aussi faibles en PGE (quelques ng/g). Les incertitudes relatives obtenues se situent en effet vers 8 à 10 % pour le Rh et Pd et l’homogénéité intrinsèque du matériau de référence BCR 723 n’apparaît pas suffisante pour atteindre les objectifs initiaux. Une procédure d’identification par recherche du Rh, Ir et Os (PGE secondaires) dans les émissions automobiles doit également être établie.

Les procédures développées permettront d’assurer la traçabilité métrologique des résultats de mesure et pourront être utilisées pour la certification des matériaux de référence. Les données ainsi obtenues permettront d’évaluer le taux d’émission de PGE de catalyseurs automobiles dans l’air ambiant.

Site du projet :

http://www.ptb.de/emrp/partemission.html

• Fournir aux équipementiers et constructeurs automobiles des méthodes pour mieux caractériser les émissions de polluants inorganiques et contribuer au développement de pots catalytiques plus respectueux de l’environnement
• Réduire les limites légales fixées pour les polluants atmosphériques provenant des automobiles
• Certifier des matériaux de référence

LABARRAQUE G., OSTER C., FISICARO P., MEYER C., VOGL J., NOORDMANN J., RIENITZ O., RICCOBONO F. ET DONET S., “Reference measurement procedures for the quantification of platinum group elements (PGEs) from automotive exhaust emissions”, International journal of environmental analytical chemistry, 95, 9, 2015, 777-789, DOI: 10.1080/03067319.2015.1058931.

• PTB (All.),
• BAM (All.),
• JRC (EC)

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En 2007, une force tripartite, composée du Brésil, de l’Union Européenne et des Etats-Unis, a toutefois publié un document (White Paper on Internationaly Compatible Biofuels Standards) mettant en évidence un manque d’harmonisation internationale des normes relatives aux biocarburants de première génération, qui constitue un obstacle à leur circulation sur le marché mondial.

Le développement de matériaux et de méthodes de référence s’avère donc crucial pour assurer la fiabilité des résultats de caractérisation de ces biocarburants liquides de première génération (bioéthanol et biodiesel). Ce constat a conduit plusieurs Laboratoires Nationaux de Métrologie européens à s’associer au sein d’un projet commun (JRP, Joint Research Project), financé en partie par la Commission Européenne et intitulé « Metrology for biofuels ». Les travaux portent à la fois sur les paramètres physiques (masse volumique, viscosité, pouvoir calorifique) et chimiques (impuretés organiques, pH, conductivité) utilisés pour évaluer la qualité du produit. Des méthodes y sont également développées pour déterminer l’origine géographique et organique des biocarburants, afin de combattre les détournements de subventions.

Le LNE, pilote de ce JRP, est intervenu plus particulièrement sur les questions de mesures de pH et de conductivité du bioéthanol, ainsi que sur la caractérisation de masses volumiques, de viscosité et de pouvoir calorifique.

Dans le cas des caractérisations électrochimiques, des mesures de pHe (pH de l’éthanol) ont été réalisées en appliquant un système primaire (cellules de Harned). La méthode a été mise au point pour les tampons phtalate et phosphate dans un mélange eau/éthanol commercial (50 wt%) aux températures de 15 °C, 25 °C et 35 °C, le protocole utilisé étant celui typiquement appliqué pour les solutions aqueuses. La comparaison des résultats obtenus dans l’eau ainsi que dans le mélange hydro-alcoolique étudié a permis de mettre en évidence l’existence d’une «erreur alcoolique», c’est-à-dire l’influence du solvant sur les caractéristiques du tampon. Cela a démontré l’importance d’étalonner les pH-mètres avec des solutions tampons appropriées.

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Le potentiel standard E⁰ de l’électrode de référence Ag/AgCl a été caractérisé dans cette solution eau – éthanol (50 wt%) et les contributions de différents paramètres dans le bilan d’incertitudes sur E⁰ ont été évaluées en fonction de la température. Il apparaît ainsi que l’impact de la fonction d’acidité sur l’incertitude des mesures de pH décroit avec la température. Les résultats montrent par ailleurs qu’il est possible d’employer ce type de tampon dans des conditions traçables pour obtenir des valeurs de pH avec un bon niveau de confiance.

L’influence de la microstructure des électrodes de référence Ag/AgCl sur leurs caractéristiques électrochimiques a également fait l’objet d’investigations. Une corrélation entre le comportement électrochimique de l’électrode et ses caractéristiques physiques de surface, et en particulier sa porosité, a ainsi pu être mise en évidence. Des suggestions ont pu être proposées d’une part pour l’utilisation de techniques non destructives pour l’évaluation de la porosité des électrodes Ag/AgCl, et d’autre part pour l’évaluation de la réponse électrochimique des électrodes Ag/AgCl en fonction de leur porosité et de la quantité d’éthanol dans le solvant (0, 30, 50 et 70 wt%). Ces résultats ont des conséquences directes quant à l’amélioration de la précision et de la comparabilité des mesures primaires de pH.

La validation de la méthode développée pour la mesure du pHe a été obtenue à travers une comparaison avec la PTB (Allemagne), l’INMETRO (Brésil) et le NMIJ (Japon) sur les deux tampons phtalate et phosphate. Les résultats montrent, à 25 °C par exemple, un écart entre les quatre laboratoires de 0.0031 pH pour le tampon phtalate et de 0.0035 pH pour le tampon phosphate. Ils sont de ce fait très satisfaisants.

• Commission de normalisation concernée BNPe P06 et P08
• Norme NF ISO 16000-3 (Décembre 2011)
• Fourniture de valeurs de référence dans le cadre d’essais d’aptitudes impliquant des laboratoires d’essais

STOICA D., BREWER P.J., BROWN R.J.C. et FISICARO P., “Influence of the preparation method on the electrochemical behaviour of Ag/AgCl reference electrodes”, Electrochimica Acta, 56, 27, 2011, 10009-10015, DOI: 10.1016/j.electacta.2011.08.089.

STOICA D., YARDIN C., VASLIN-REIMANN S. et FISICARO P., “Evaluation of standard potential of Ag/AgCl electrode in a 50 wt% water-ethanol mixture”, Journal of Solution Chemistry, 40, 11, 2011, 1819-1834, DOI: 10.1007/s10953-011-9758-3.

BREWER P.J., STOICA D. et BROWN R.J.C., “Sensitivities of key parameters in the preparation of silver/silver chloride electrodes used in Harned cell measurements of pH”, Sensors, 11, 8, 2011, 8072-8084, DOI: 10.3390/s110808072.

LARDY-FONTAN S., CABILLIC J., PEIGNAUX M., STUMPF C., LEPOT B., LEOZ E., MIEGE C. et LALÈRE B., “The usefulness of assignation of reference values in inter laboratories comparisons French demonstrations in the field of environmental survey”, IMEKO TC Conference (TC8 - TC23 - TC24) “Metrological traceability in the globalisation age”, Paris, France, 6-8 avril 2011.

STOICA D. et FISICARO P., “Determination of standard pH values for reference potassium hydrogen phtalates buffer solutions in water-ethanol mixture (50 wt%)”, 15^e Congrès international de métrologie, Paris, France, 3-6 octobre 2011.

• BAM (DE),
• PTB (DE),
• DFM (DK),
• VSL (NL),
• INRIM (IT),
• SP (SW),
• NPL (GB),
• LGC (GB),
• TÜBITAK (Turq.),
• JRC-IRMM (UE),
• NEL (GB),
• Université de Rostock (DE),
• METROSERT (ES)

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Actuellement trois marqueurs biologiques du liquide céphalo-rachidien (LCR) semblent pouvoir permettre cette avancée : la diminution de la concentration des peptides Bêta Amyloïdes (1-40 et 1-42), l’augmentation de la concentration de la protéine t-Tau (plus particulièrement d’une forme phosphorylée de cette dernière : P-Tau(181)) et l’hepcidine, marqueur secondaire. Du point de vue analytique, ces marqueurs sont détectables dans le LCR par des techniques immunologiques, de type tests ELISA. Il faut cependant utiliser une combinaison de plusieurs de ces immuno-dosages pour couvrir les différents biomarqueurs nécessaires au diagnostic a minima de la maladie. En parallèle, depuis quelques années, des approches de spectrométrie de masse ciblées et quantitatives permettant de s’affranchir d’outils immunologiques sont développées. Leur utilité ne se résume pas aux méthodes de référence : elles disposent d’un très fort potentiel en biologie clinique où elles sont considérées comme une technologie d’avenir utilisable en routine. Un apport métrologique est nécessaire pour évaluer la justesse des méthodes utilisées en routine, raccorder les résultats aux unités du Système International, les rendre comparables d’une plate-forme analytique à une autre et in fine fournir des mesures plus fiables.

Le LNE est actuellement reconnu pour la fourniture des valeurs de référence dans le cadre d’essais d’aptitude visant à évaluer la qualité des analyses de biologie médicale reposant sur le dosage de petites molécules. Toutefois, la quantification absolue de protéines présente une complexité nettement supérieure en raison de leur grande taille et de leur importante hétérogénéité structurale, qui rend difficile la définition du mesurande (car la protéine tau totale est en réalité constituée d’un mélange de protéines) et la caractérisation métrologique de la pureté des étalons primaires utilisés pour raccorder les résultats au système international d’unités.

L'objectif de ce projet consiste à développer, optimiser et valider des méthodes de référence en spectrométrie de masse ciblée pour la quantification absolue des biomarqueurs de la maladie d’Alzheimer. Cela concerne en particulier le dosage dans le LCR des formes 1-38, 1-40 et 1-42 des peptides bêta Amyloïdes, de la protéine Tau (Tau totale et P-Tau(181)), mais également d’un marqueur secondaire, l’Hepcidine. Ces thématiques ont fait l’objet d’un travail de thèse, soutenue en 2016.

Les principaux enjeux de ce projet résident dans la capacité à développer des méthodes spécifiques, sensibles pour permettre de quantifier de manière absolue des concentrations très faibles de biomarqueurs (quelques centaines de pg/mL) dans des milieux biologiques complexes.

Une fois ces méthodes de référence validées, elles ont pour vocation d’être utilisées pour certifier :

• Des étalons internationaux permettant de standardiser et rendre traçables aux SI les résultats obtenus avec les méthodes immunologiques utilisées en routine ;
• Des matériaux de référence permettant d’évaluer la justesse des méthodes de routine avant et après standardisation.

Les premières méthodes d’analyse des peptides β amyloïdes par spectrométrie de masse utilisaient les techniques MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization) et SELDI (Surface Enhanced Laser Desorption Ionization) couplées à un ToF (Time of Flight). Ensuite, des méthodes LC-MS/MS (Liquid Chromatography coupled to tandem Mass Spectrometry) ont été développées pour la quantification absolue des peptides β amyloïdes Aβ 1-40 et 1-42 principalement. Deux d’entre elles utilisant des protocoles similaires ont été reconnues par le Joint Committee for Traceability in Laboratory Medecine (JCTLM) comme méthodes de référence pour la quantification absolue du peptide Aβ 1-42 par LC-MS/MS. La quantification est basée sur la dilution isotopique par ajout d’un étalon Aβ 1-42 marqué isotopiquement.

Concernant la protéine Tau, une méthode de dosage de 7 peptides de la protéine dans le LCR a été développée par LC-MS/MS sur un spectromètre de masse de type triple quadripôle. Bien que ces 7 peptides ne permettent pas de discriminer les différentes isoformes de la protéine Tau, la méthode a été validée.

Finalement, cette étude a permis d’avancer sur la caractérisation de l’étalon hepcidine dans le but de produire un matériau de référence certifié améliorant la comparabilité du dosage de l’hepcidine.

• Développement de la méthode de dosage de peptides Bêta Amyloïdes par LC-MS/MS.
• Dosage de la protéine Tau par extraction SPE de la protéine dans le LCR puis digestion par voie enzymatique et quantification par µLC-MS/MS.
• Travaux en cours sur la caractérisation de deux étalons d’hepcidine issus de synthèses différentes par LC-hrMS et mobilité ionique.
• Intégration du Working Group IFCC CSF par le LNE

ELABY C., VIALARET J., BROS P., GABELLE A., LEFEBVRE T., PUY H., HIRTZ C., LEHMANN S., “Clinical measurement of Hepcidin-25 in human serum: Is quantitative mass spectrometry up to the job?”, EuPA Open Proteomics, 3, 2014, 60-67.

BROS P., DELATOUR V., VIALARET J., LALERE B., BARTHELEMY N., GABELLE A., LEHMANN S. et HIRTZ C., “Quantitative detection of amyloidbetapeptides by mass spectrometry: state of the art and clinical applications”, Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (CCLM), 53, 10, 2015, 1483-1493, DOI: 10.1515/cclm-2015-099.

BROS P., VIALARET J., BARTHELEMY N., DELATOUR V., GABELLE A., LEHMANN S. et HIRTZ C., “Antibody-free quantification of seven tau peptides in human CSF using targeted mass spectrometry”, Frontiers in Neuroscience, 9, 2015, 302, 1-8, DOI: 10.3389/fnins.2015.00302.

LEHMANN S., BREDE C., LESCUYER P., COCHO JA., VIALARET J., BROS P., DELATOUR V. et HIRTZ C., “Clinical mass spectrometry proteomics (cMSP) for medical laboratory: What does the future hold?”, Clin Chim Acta,  S0009-8981(16), juin 2016, pii: 30246-7, DOI: 10.1016/j.cca.2016.06.001.

DELABY C., BROS P., VIALARET J., MOULINIER A., DELATOUR V., GABELLE A., LEHMANN S., HIRTZ C., “Quantification of hepcidin-25 in human cerebrospinal fluid using” LC-MS/MS Bioanalysis, 9(4), 2017, 337-347, DOI: 10.4155/bio-2016-0240.

BROS P., JOSEPHS RD., STOPPACHER N., CAZALS G., LEHMANN S., HIRTZ C., WIELGOSZ RI., DELATOUR V.,  “Impurity determination for hepcidin by liquid chromatography-high resolution and ion mobility mass spectrometry for the value assignment of candidate primary calibrators”, Anal Bioanal Chem, 409, avril 2017, 2559-2567,  DOI: 10.1007/s00216-017-0202-4.

BRINET D., GAIE-LEVREL F., DELATOUR V., KAFFY J., ONGERI S. et TAVERNA M., “In vitro monitoring of amyloid β-peptide oligomerization by Electrospray differential mobility analysis: An alternative tool to evaluate Alzheimer's disease drug candidates”, Talanta, 165, 2017, 84-91, DOI: 10.1016/j.talanta.2016.12.011.

DIEPEVEEN L.E., LAARAKKERS C.M.M., MARTOS G., PAWLAK M.E., UĞUZ F.F., VERBERNE KESA, VAN SWELM R.P.L., KLAVER S, DE HAAN A.F.J., PITTS K.R., BANSAL S.S., ABBAS I.M., FILLET M., LEFEBVRE T., GEURTS-MOESPOT A.J., GIRELLI D., CASTAGNA A., HERKERT M., ITKONEN O., OLBINA G., TOMOSUGI N., WESTERMAN M.E., DELATOUR V., WEYKAMP C.W., SWINKELS D.W., « Provisional standardization of hepcidin assays: creating a traceability chain with a primary reference material, candidate reference method and a commutable secondary reference material », Clinical Chemistry and Laboratory Medicine, 2018 doi: 10.1515/cclm-2018-0783

DELATOUR V., PEIGNAUX M., LALERE B. et VASLIN-REIMANN S., « Caractérisation et quantification de peptides pour la protéo-mique quantitative », Adebiotech, Paris, France, 3 octobre 2012.

BROS P., BARTHELEMY N., VIALARET J., BECHER F., GABELLE A., DELATOUR V., LEHMANN S. et HIRTZ C., “Comparison of PRM and SRM analytical performances for the quantification of Tau protein in human C”, SMAP 2014 : Congrès français de Spectrométrie de Masse et d’Analyse Protéomique, Lyon, France, juin 2014.

BROS P., DELABY C., DELATOUR V., MOULINIER A., CAZALS G., VIALARET J., LEHMANN S. et HIRTZ C., “Towards a reference method for absolute quantification of hepcidin-25 in serum by mass spectrometry”, Congrès Euromedlab/IFCC, Paris, France, 21-25 juin 2015.

• Laboratoire de Biochimie et de Protéomique Clinique de l’IRB (Institut de Recherches en Biothérapie, Montpellier),
• CEA Saclay,
• faculté de pharmacie de Chatenay Malabry,
• LGC (UK),
• PTB (DE),
• SP (SE),
• INIRM (IT),
• Hôpital universitaire de la Charité de Berlin (DE),
• University College London (UK),
• CHU Montpellier,
• Université d'East Anglia,
• PPD,
• ADx NeuroSciences,
• Roche,
• Fujirebio,
• Eurobio,
• Eurogentec